Onderzoek

Studie van complexe eiwitten (hemocyanines) en eiwitderivaten (gelatines).

(i) Hemocyanines
Hemocyanines zijn hoge-M_r koperproteïnen die aangetroffen worden in de hemolymfe van verschillende artropoden en mollusken. Hun hoofdfunctie is zuurstoftransport. Via fenoloxidase-activiteit spelen zij echter ook een rol in het immuunsysteem van de dieren waarin zij voorkomen.
Wij bestudeerden voornamelijk mollusk hemocyanines. Deze zijn samengesteld uit subeenheden (10 of 20) die zelf opgebouwd zijn uit zogenaamde functionele eenheden. Een functionele eenheid is een entiteit van ~50 kDa die een koperpaar (actieve plaats) bevat waaraan een dizuurstofmolecule kan binden. In ons onderzoek werden functionele eenheden vrijgemaakt uit de subeenheden door beperkte proteolyse; deze functionele eenheden werden vervolgens afgezonderd door toepassing van verschillende chromatografische technieken.
Als prototypes fungeerden de hemocyanines van de gastropood Helix pomatia (wijgaardslak) en de cefalopood Sepia officinalis (gewone inktvis). In samenwerking met Prof. K. Idakieva (Bulgaarse Academie voor Wetenschappen, Sofia) werd ook het hemocyanine van de waterslak Rapana thomasiana (levend in de Zwarte Zee) bestudeerd.
De studie was de laatste jaren toegespitst op de bepaling van de intrinsieke fenoloxidase-activiteit van de hemocyanines en hun functionele eenheden en op de inductie van verhoogde enzymactiviteit door behandeling met verschillende (bio)chemische agentia (zoals proteïnasen, piperazine ...). De enzymactivering is waarschijnlijk het gevolg van subtiele conformatiewijzigingen. De conformationele stabiliteit (hitte- en drukstabiliteit), voor en na enzyminductie, werd bestudeerd met behulp van Fourier getransformeerde infrarood (FTIR) spectroscopie, in samenwerking met Dr. Filip Meersman (Departement Chemie, Afdeling Moleculaire en Nanomaterialen). De bedoeling was na te gaan of de fenoloxidase-activiteit gecorreleerd is met de conformationele stabiliteit en flexibiliteit van de functionele eenheden.

(ii) Gelatines
Gelatines zijn water-oplosbare proteïnesubstanties bekomen door denaturatie en partiële hydrolyse van collageen. Omwille van de aanwezigheid van componenten met verschillende moleculaire massa blijven voorlopig een aantal fundamentele vragen betreffende het geleringsmechanisme onbeantwoord (b.v. wat is de rol van individuele collageenachtige ketens en van interketen "cross-links"?). Daarom werden gelatines van verschillende oorsprong, ons ter beschikking gesteld door PB Gelatins (Vilvoorde), gefractioneerd door coacervatie en gelchromatografie, zodanig dat opgezuiverde fracties (o.a. a1 en a2) apart konden onderzocht worden. Het gelerings- en smeltgedrag van deze fracties werd bestudeerd met FTIR spectroscopie (in samenwerking met Dr. Filip Meersman).

Publicaties

GIELENS, C., IDAKIEVA, K., VAN DEN BERGH, V., SIDDIQUI, N.I., PARVANOVA, K., & COMPERNOLLE, F.
Mass spectral evidence for N-glycans with branching on fucose in a molluscan hemocyanin.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 562-570 (2005).

SIDDIQUI, N.I., PRÉAUX, G., & GIELENS, C.
Induction of phenoloxidase activity in the beta-hemocyanin of the gastropod Helix pomatia by limited proteolysis.
30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference, Budapest, Hungary, 2-7 July 2005, Abstract B2-037P, FEBS Journal 272, Supplement 1, p. 159 (2005).

IDAKIEVA, K., SIDDIQUI, N.I., PARVANOVA, K., NIKOLOV, P. & GIELENS, C.
Fluorescence properties and conformational stability of the b-hemocyanin of Helix pomatia.
Biochim. Biophys. Acta 1764, 807-814 (2006).

SIDDIQUI, N.I., AKOSUNG, R.F., & GIELENS, C.
Location of intrinsic and inducible phenoloxidase activity in molluscan hemocyanin.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 1138-1144 (2006).

GIELENS, C., IDAKIEVA, K., DE MAEYER, M., VAN DEN BERGH, V., SIDDIQUI, N.I. & COMPERNOLLE, F.
Conformational stabilization at the active site of molluskan (Rapana thomasiana) hemocyanin by a cysteine-histidine thioether bridge. A study by mass spectrometry and molecular modeling.
Peptides 28, 790-797 (2007).

KAMOUNE, L., DE BORGGRAEVE, W.M., GIELENS, C., VOET, A., ROBEYNS, K., DE MAEYER, M., VAN MEERVELT, L., COMPERNOLLE, F. & HOORNAERT, G.
Design, synthesis and evaluation of serine protease inhibitor analogues.
Eur. J. Org. Chem., 2977-2986 (2007).

IDAKIEVA, K., GIELENS, C., SIDDIQUI, N.I., DOUMANOVA, L., VASSEVA, B., KOSTOV, G. & SHNYROV, V.L.
Irreversible thermal denaturation of b-hemocyanin of Helix pomatia and its substructures studied by differential scanning calorimetry.
Z. Naturforsch. 62a, 499-506 (2007).

SIDDIQUI, N.I., IDAKIEVA, K., DEMARSIN, B., DOUMANOVA, L., COMPERNOLLE, F. & GIELENS, C.
Involvement of glycan chains in the antigenicity of Rapana thomasiana hemocyanin.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 361, 705-711 (2007).

VANLAER, S., DE BORGGRAEVE, W.M., VOET, A., GIELENS, C., DE MAEYER, M. & COMPERNOLLE, F.
Spirocyclic pyridoazepine analogues of galanthamine: Synthesis, modelling studies and evaluation as inhibitors of acetylcholinesterase.
Eur. J. Org. Chem., 2571-2581 (2008).

YESILYURT, B., GIELENS, C. & MEERSMAN, F.
Thermal stability of homologous functional units of Helix pomatia hemocyanin does not correlate with carbohydrate content.
FEBS Journal 275, 3625-3632 (2008).

CHYS, P.
Application of geometric algebra for the description of polymer conformations.
J. Chem. Phys. 128, 104107 1-12 (2008).

SIDDIQUI, N.I., YIGZAW, Y., PRÉAUX, G. & GIELENS, C.
Involvement of glycans in the immunological cross-reaction between a-macroglogulin and hemocyanin of the gastropod Helix pomatia.
Biochimie 91, 508-516 (2009).

IDAKIEVA, K., SIDDIQUI, N.I., MEERSMAN, F., DE MAEYER, M., CHAKARSKA, I. & GIELENS, C.
Influence of limited proteolysis, detergent treatment and lyophilization on the phenoloxidase activity of Rapana thomasiana hemocyanin.
Int. J. Biol. Macromol. 45, 181-187 (2009).

GIELENS, C., IDAKIEVA, K. & MEERSMAN, F.
Thermal stability and phenoloxidase activity of molluscan hemocyanins and their functional units.
16th International Conference on Oxygen Binding and Sensing Proteins, Antwerp, Belgium, 22-26 August 2010, Abstract P41, Abstract book p. 99 (2010)

CHYS, P., GIELENS, C. & MEERSMAN, F.
FTIR 2D correlation spectroscopy of alfa-1 and alfa-2 fractions of an alkali-pretreated gelatin.
Biochim. Biophys. Acta 1814, 318-325 (2011).

IDAKIEVA, K., MEERSMAN, F. & GIELENS, C.
Reversible heat inactivation of copper sites precedes thermal unfolding of molluscan (Rapana thomasiana) hemocyanin.
Biochim. Biophys. Acta 1824, 731-738 (2012).

Technieken

• Diverse vormen van chromatografie en elektroforese
• Spectrofotometrie
• Oxygenatiemetingen
• Polarimetrie
• Ultracentrifugatie
• Lichtverstrooiing
• Beperkte en gevorderde proteolyse
• Lyofilisatie
• Immunologische technieken

Contact

Em. Prof. Constant GIELENS, ere-hoofddocent
Laboratorium voor Biochemie (Proteinenchemie)
Departement Chemie
Afdeling Biochemie, Moleculaire en Structurele Biologie
Celestijnenlaan 200 G
3001 Leuven-Heverlee
Constant.Gielens@chem.kuleuven.be